Точное определение содержания клетчатки - один из ключевых показателей при оценке питательной ценности и качества кормов для животных. От него напрямую зависят продуктивность скота, эффективность усвоения рациона и экономика кормового производства: затраты на корма составляют до 70% себестоимости животноводческой продукции. В настоящей статье рассмотрены методы анализа, регламентированные ГОСТ ISO 16472-2014 и ГОСТ ISO 13906-2013, в основе которых лежит международно признанный детергентный метод Ван Соеста, а также практические аспекты внедрения этих методов в лабораторный процесс.
Метод Ван Соеста основан на принципе разделения компонентов корма на две фракции: легкопереваримое клеточное содержимое (крахмал, сахара, белки, жиры) и труднодоступные клеточные стенки (целлюлоза, гемицеллюлоза, лигнин). Для их разделения последовательно применяются нейтральный и кислотный детергентные растворы. Такой подход позволяет получить точные и воспроизводимые характеристики фракционного состава клетчатки, в отличие от классического метода Веенде (сырая клетчатка), который занижает истинное содержание волокна.
НДК - это массовая доля нерастворимого волокнистого остатка, определяемая по методу, установленному в ГОСТ ISO 16472-2014 («Корма для животных. Определение содержания нейтрально-детергентной клетчатки с применением амилазы»). Метод использует раствор нейтрального детергента совместно с термостабильной альфа-амилазой для растворения крахмала, легко перевариваемых белков, жиров, сахаров и пектинов. Нерастворимый остаток представляет собой суммарные компоненты клеточных стенок растительных материалов.
Состав НДК: гемицеллюлоза + целлюлоза + лигнин (+ нерастворимые азотистые вещества в кормах животного происхождения).
Область применения: оценка суммарного содержания структурной клетчатки, расчёт энергетической ценности и потенциала перевариваемости корма, нормирование объемистых кормов в рационах жвачных животных. Результат выражается в процентах массовой доли и согласно ГОСТ ISO 16472-2014 рассчитывается как разность масс тигля с остатком после экстракции и сушки и тигля до внесения пробы, с поправкой на холостой опыт.
КДК и КДЛ определяются по ГОСТ ISO 13906-2013 («Корма для животных. Определение содержания кислотно-детергентной клетчатки и кислотно-детергентного лигнина»).
КДК (кислотно-детергентная клетчатка) - массовая доля остатка, содержащего целлюлозу, лигнин и нерастворимые протеиновые комплексы, получаемого после обработки пробы раствором катионного детергента (цетил триметил аммония бромид) в серной кислоте молярной концентрацией 0,5 моль/дм3 . Гемицеллюлоза при этом растворяется. Предел определения методики - 1,0 % по массовой доле.
КДЛ (кислотно-детергентный лигнин) - массовая доля остатка, получаемого после дополнительной обработки остатка КДК раствором серной кислоты с массовой долей 72% (12 моль/дм3). Целлюлоза при этом растворяется, а лигнин остаётся и определяется гравиметрически. Предел определения методики - 1,5% по массовой доле.
Область применения: оценка трудноперевариваемой части корма, контроль содержания лигнина, расчёт переваримости целлюлозы как разности КДК и КДЛ, оценка качества грубых и объемистых кормов.
Пробу высушивают при температуре не выше 60°С (для предотвращения образования искусственной клетчатки) и измельчают до среднего размера частиц 220-260 мкм. Навеску массой (1 ± 0,001) г помещают в тигель или колбу для кипячения с обратным холодильником. К пробе добавляют (0,5 ± 0,1) г сернистокислого натрия, (50 ± 5) см3 раствора нейтрального детергента и 2 см3 стандартизованного раствора термостабильной альфа-амилазы. Смесь нагревают до кипения (4-5 мин) и кипятят 60 минут. После фильтрования через тигель Гуча остаток промывают горячей водой (не менее 95 °С) с повторной обработкой амилазой, затем ацетоном. Тигель сушат при (105 ± 1) 0С не менее 8 часов, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Для пересчёта на органическое вещество дополнительно проводят озоление при (500 ± 20) 0С в течение 5 часов.
Результат (содержание аНДК, %) рассчитывается гравиметрически с поправкой на холостой опыт и выражается с точностью до 0,1%.
Этап 1 - определение КДК. Навеску пробы массой (1000 ± 2) мг помещают в колбу Берцелиуса или тигель , добавляют 100 см3 раствора кислотного детергента (20 г ЦТАБ на 1дм3 0,5 моль/дм3 H2SO4) и 2-4 капли н-октанола (пеногаситель). Нагревают до кипения за 5-10 мин и кипятят (60 ± 5) мин. Раствор фильтруют через тигель с фриттовым стеклом, остаток трижды промывают горячей водой при 90-100 °С, затем ацетоном. Тигель сушат при (103 ± 2) 0С не менее 5 часов, охлаждают и взвешивают - получают массу КДК-остатка.
Этап 2 - определение КДЛ. К остатку в тигле добавляют 72%-й раствор серной кислоты (охлаждённый до 15 °С), перемешивают до образования однородной пасты и выдерживают 3 часа при температуре 20- 23 °С, периодически перемешивая. Затем фильтруют с помощью вакуума, промывают горячей водой до нейтральной реакции по лакмусу. Тигель сушат, взвешивают, затем прокаливают при (525 ± 15) 0С не менее 3 часов и снова взвешивают. КДЛ определяют как разность масс до и после прокаливания.
Для реализации методов по ГОСТ ISO 16472-2014 и ГОСТ ISO 13906-2013 используется три класса приборов:
Полуавтоматические анализаторы клетчатки - базируются на принципе кипячения с обратным холодильником и вакуумной фильтрации. Обеспечивают одновременный анализ нескольких проб. Требуют участия оператора на этапах взвешивания, переноса остатка, фильтрации и добавления реагентов.
Полностью автоматические анализаторы клетчатки - выполняют все стадии анализа (добавление реагентов, кипячение, фильтрацию, промывку, сушку) без участия оператора. Время работы оператора сокращается до минимума. Подходят для высокопроизводительных лабораторий.
Экстракторы холодной экстракции - используются для предварительного обезжиривания проб с содержанием жира более 5-10% (требование обоих ГОСТов), а также для промывки остатков ацетоном.
Ключевым расходным материалом являются тигли с фриттовым стеклом. Согласно обоим стандартам, тигли крупной пористости (40-60 мкм для тиглей Гуча, 40-100 мкм для типа Р2, объём 40-50 см3) обеспечивают соответствие официальным методам.
Каждый тигель рассчитан на многократное применение: после каждого использования его прокаливают при (525 ± 15) 0С в течение 3 часов с ультразвуковой очисткой. Стойкость тиглей к кислотным и щелочным средам - обязательное требование при работе с 72%-й серной кислотой в процессе определения КДЛ.
Дополнительные расходники: термостабильная альфа-амилаза (стандартизуется по активности перед каждым использованием), вспомогательные средства для фильтрования (диатомитовая земля, кварцевый песок -для сложных матриц), ацетон аналитической чистоты, н-октанол.
Оба стандарта требуют предварительной сушки влажных проб при температуре не выше 60 °С - это критически важно для предотвращения образования искусственной клетчатки и занижения результатов. Пробы с содержанием жира 5% и более подлежат предварительному обезжириванию ацетоном. Навески берут с точностью до 1 мг (для КДК/КДЛ - до 2 мг). Размол проводят на циклонной или режущей мельнице до частиц 220-260 мкм; весь материал, не прошедший через сито, включается в навеску.
Активность раствора альфа амилазы проверяют каждые 6 месяцев, а при смене партии - обязательно. Скорость фильтрования тиглей контролируется периодически: время слива 50 см3 воды без вакуума должно составлять (180 ± 60) с для тиглей Гуча или (75 ± 30) с для тиглей Р2. Тигли с отклонением от нормы бракуют или направляют на кислотную/щелочную очистку.
Согласно требованиям обоих стандартов, в каждую серию из 20 - 30 проб обязательно включают не менее одного образца внутреннего контроля качества (КК) и два холостых опыта. Изменение массы холостых тиглей после экстракции или озоления не должно превышать 10 мг. Рекомендуемое стандартное отклонение для КК-материала - не более ±1,0% по НДК.
Выполнение анализов требует понимания техники гравиметрии, работы с агрессивными реагентами (72%-я серная кислота) и вакуумным оборудованием. Персонал должен пройти инструктаж по технике безопасности и быть обучен процедуре стандартизации раствора амилазы по Приложению В ГОСТ ISO 16472-2014.
Задача: Определение нерастворимой клетчатки в рационе для свиней.
Расчеты (на органическое вещество) :
m ce - масса пробы и тигля после экстракции и сушки, г;
m ca - масса тигля, включая средство для фильтрования, после прокаливания, г;
m be- средняя масса тигля холостого опыта, включая средство для фильтрования после экстракции и сушки,г;
m ba - средняя масса тигля холостого опыта, включая средство для фильтрования после прокаливания,г;
m s - масса анализируемой пробы, г.
Оборудование и стандарты:
Использована автоматизированная экстракционная установка (FIWE Advance) для стандартизации условий экстракции, удобной фильтрации и сокращения времени анализа (примерно 2 ч с аппаратом против ~6 часов вручную). Метод согласно ГОСТ ISO 16472-2014.
Результаты: Допустимый диапазон для пробы: 13,4 – 21,8 г /100
| m s | m ce | m ca | aNDF % |
| Холостой опыт | 31,1442 | 31,1362 | |
| 0,4985 | 31,6998 | 31,5990 | 18,62 |
| 0,5035 | 30,8374 | 30,7344 | 18,87 |
| 0,5091 | 31,2289 | 31,1265 | 18,54 |
| 0,4972 | 31,8134 | 31,7135 | 18,48 |
| 0,5002 | 31,4048 | 31,3037 | 18,61 |
| Среднее 土 SD % | 18,62土 0.15 | ||
| RSD % | 0,8 |
Выбор метода анализа клетчатки определяется задачами лаборатории. Для оценки суммарного содержания структурного волокна и расчёта энергетической ценности кормов применяется метод НДК по ГОСТ ISO 16472-2014. Для более детальной характеристики труднодоступной части корма, включая определение лигнина, - последовательное определение КДК и КДЛ по ГОСТ ISO 13906-2013. Оба метода могут применяться в рамках одной лаборатории, дополняя друг друга.
Правильно подобранное оборудование и расходники - основа точных и воспроизводимых результатов. Ознакомьтесь с каталогом анализаторов клетчатки или запросите консультацию специалиста - мы поможем подобрать оптимальную конфигурацию для вашей лаборатории и сопроводить внедрение методики.
